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测序

  • 样本制备篇--高通量核酸提取


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  • 样本制备篇--FFPE核酸提取

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  • 样本制备篇--样本质控与定量

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  • 文库构建篇--核酸片段化系统

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  • 文库构建篇--核酸片段筛选回收系统

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  • 文库构建篇—高效DNA建库试剂盒



    NEBNext Ultra Ⅱ DNA 文库构建产品

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    NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒能够用更低起始量的 DNA 构建高质量的文库。文库制备每一个步骤中的试剂都经过优化,能够从 500 pg 1 μg 的起始 DNA 高效构建高质量的文库。新一代的 NEBNext 试剂采用了快速、流程化、自动化的工作流程,在降低 PCR 循环数的同时提高了 GC 覆盖度。本试剂盒与 PCR-free 的工作流程兼容,且对于难以建库的样本,如 FFPE 样本,也有很好的效果。

    优势:

    更高的文库产量,满足您更多需求;

    即使在 DNA 样本量非常低的情况下(低至 500 pg),依旧能够产生高质量的文库;

    适用于所有 DNA 样本,包括富含 GC 的区域及 FFPE-DNA 样本;

    提高靶向富集等应用的产量及质量;

    流程化的操作过程,操作时间大大减少,与自动化建库设备兼容;试剂盒和模块提供了极大的选择灵活性。

    NEBNext Ultra II DNA建库工作流程

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    NEBNext Ultra II DNA文库试剂盒组成

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    A 以人 NA19240 基因组 DNA 为样本制备文库,起始量和 PCR 循环数如图所示。文库构建按照各生产商推荐方法进行,省略片段筛选的步骤。

    B 以人 NA19240 基因组 DNA 为样本制备文库,起始量和制备试剂盒如图所示,文库的构建按照生产商推荐的方法进行,不进行扩增步骤。接头连接的分子用 qPCR 进行定量,定量的结果以 Ultra II 的转化率为基准进行标准化处理。对于不同起始量 DNA Ultra II 试剂盒均能产生最高的接头连接分子转化效率。

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    500 pg1 ng 100 ng 的基因组 DNA 为起始样本,使用 Ultra II DNA 文库制备试剂盒进行建库后使用 Illumina MiSeq? 测序。使用 Bowtie 2.2.4 Reads 进行比对并使用 Picard's Collect GC Bias

    Metrics (v1.117) 计算 GC 覆盖度。预期的标准化覆盖度 1.0 以灰色的水平线表示,不同 GC% 100 bp 区域的数量以灰色条形图显示。不同颜色的线形图表示标准化后的文库覆盖度。

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    100 ng NA19240 基因组 DNA 为起始样本构建文库,文库制备试剂盒如图所示,文库的构建按照生产商推荐的方法进行,不进行扩增步骤。文库产量用 NEBNext 文库定量试剂盒进行 qPCR 定量。使用NEBNext Ultra II 试剂盒得到的文库产量最高。

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    100 ng NA19240 基因组 DNA 为起始样本构建文库,使用的文库制备试剂盒如图所示,文库的构建按照生产商推荐的方法进行,不进行扩增步骤。文库使用 Illumina NextSeq 500 进行测序。测序得到的

    Reads 使用 Bowtie 2.2.4 比对到 GRCh37 参考基因组。数据显示 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒

    PCR-free 实验流程中得到高质量的测序读数,即使在起始量非常低的情况下。

     % Mapped: 比对到 GRCh37 参考基因组的百分比。

    % Duplication: 比对序列中重复的百分比。

    % Chimeras: 序列中超过最大插入片段或两端比对到不同染色体上的百分比。

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    17-30 ng FFPE 组织样本中提取的 DNA 为起始样本制备文库,组织来源如上表所示,扩增循环数为 10 个循环,用Illumina MiSeq 进行测序。

    测序得到的 Reads 使用 Bowtie 2.2.4 比对到 GRCh37 参考基因组

    % Mapped: 比对到 GRCh37 参考基因组的百分比。

    Mapped in Pairs: mate pair 也能比对到参考基因组的百分比。
    % Duplication: 比对序列中重复的百分比。

    % Chimeras: 序列中超过最大插入片段或两端比对到不同染色体上的百分比。

    数据显示使用 NEBNext DNA 文库制备试剂盒能够获得高质量的测序结果,即使是起始量非常低的 FFPE 样本。

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    当使用 Nimblegen 进行靶向富集时,首先以 100 ng HG02922 基因组 DNA 为起始样本,分别使用NEBNext Ultra II NEBNext 接头引物,或 Kapa 文库制备试剂盒 SeqCap接头(Roche)。随后的靶向富集使用 NimbleGen SeqCap Human Exome v3 试剂盒完成。

    当使用 Sureselect 进行靶向富集,首先以 200 ng HG02922 基因组 DNA 为起始样本,分别使用

    NEBNext Ultra II NEBNext 接头引物,Kapa 文库制备试剂盒及 NEBNext 接头引物,和 SureSelect Reagent KitIllumina (ILM) 平台配合 Herculase? II Fusion DNA 聚合酶进行建库。随后的靶向富集使用 SureSelectHuman All Exon V6 试剂盒完成。

    实验均按照生产商推荐的方法进行,包括推荐的 PCR 循环数及捕获前和捕获后处理。使用 NEBNext Ultra II 构建的文库在两种富集方法下均可获得更高的捕获后产量。

  • 文库构建篇——高效RNA建库试剂盒

    Even more from Less - NEBNext Ultra II RNA 文库制备试剂盒

    您是否需要提高 RNA-seq 实验的灵敏度与特异性?您是否遇到更低起始量样本?为了解决这些挑战,新一代的 RNA 文库制备试剂盒中每一个步骤

    都经过优化,在更低起始量,更少循环数的条件下,依旧能够得到数倍产量的高质量文库。文库制备试剂盒流程化,自动化的操作流程,适用于

    定向(链特异性文库,使用“dUTP”方法(1,2))及非定向文库制备,更有包含 SPRISelect? 磁珠的形式,方便片段筛选及纯化步骤。

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    分别使用 NEBNext Ultra II RNA 定向文库制备试剂盒 (搭配NEBNext Poly(A) mRNA 磁性分离模块),Kapa Stranded mRNA-SeqKit, Kapa mRNA HyperPrep Kit,Illumina TruSeq Stranded mRNA

    Kit将带有 Poly(A) 尾的 mRNA 从 Human Universal Reference RNA(Agilent #740000) 中分离出来建库。制备好的文库在 Illumina NextSeq? 500 平台用双端模式 (2x76 bp) 测序。Reads 比对到hg19 参考基因组。每个文库的 GC 含量分布使用比对上的reads 进行计算。NEBNext Ultra II 定向 RNA 文库制备试剂盒制备的文库在不同起始量条件下有均一的 GC 含量分布,而其他试剂盒 GC 含量分布会随着不同起始量产生变化,显示了起始量依赖序偏嗜性。

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                                 *以上内容来源于NEB(北京)

  • 三代测序篇--第三代单分子测序系统

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